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光學顯微鏡的基本構造

時間：2022-04-11 09:14:40 數碼

光學顯微鏡的基本構造

　　導語：光學顯微鏡在生物學中已經非常的廣泛了，在各大領域都能用到，如何做到了解顯微鏡的使用方法，那就需要了解顯微鏡的基本構造，才能知道怎么使用。下面小編介紹一下光學顯微鏡的基本構造吧!

　　光學顯微鏡的基本構造

　　鏡座

　　位于顯微鏡底部，呈馬蹄形，它支持全鏡。

　　鏡臂

　　位于鏡筒后面，為弓形，起支持鏡筒和搬移顯微鏡時握持部位。有固定和活動式兩種，鏡臂可改變角度。

　　鏡柱

　　是在鏡座后方中部直立向上的部分，支持鏡臂及以上部分。

　　轉換器

　　位于鏡筒下方，為兩個金屬碟合成的一個轉盤，有3~4個圓孔，可裝配不同放大率的物鏡，可使每個物鏡通過鏡筒與目鏡構成一個放大系統。

　　載物臺

　　也叫工作臺或鏡臺，方形或圓形，為放置標本之用。載物臺上有兩個金屬壓夾，用作固定玻片標本。有的載物臺上裝有玻片移動器，可固定和移動標本之用。載物臺中央有一通光孔，反射鏡反射上來的光線，通過通光孔而透到標本上。

　　調焦裝置

　　為了得到清晰的圖像，必須調節物鏡與標本之間的距離，使物鏡的焦點對準標本，這一操作叫調焦。在顯微鏡的鏡臂上裝有大小螺旋各一對。大的叫粗動調焦螺旋每旋轉一周可使鏡筒升降20毫米;小的微動調焦螺旋，每旋轉一周可使鏡筒升降0.1毫米或更小。由于顯微鏡型號的不同，調焦有不同方式。較新型的顯微鏡，借助調焦螺旋，使載物臺升降進行調焦。

　　物鏡

　　安裝在鏡筒下端的物鏡轉換器下方，因為它靠近被視物體，故又稱接物鏡。物鏡是決定顯微鏡性能如分辨力的最重要的構件。物鏡的作用是將標本第一次放大成倒像。一臺顯微鏡備有數個物鏡，每個物鏡由數片不同球面半徑的透鏡組成。物鏡下端的透鏡口徑越小，鏡筒越長，其放大倍數越高;否則反之。物鏡有低倍物鏡和高倍物鏡，其放大倍數一般刻在物鏡的鏡筒上，例如4×、8×、10×、40×、45×、65×、90×、100×，分別表示4倍、8倍、10倍……。其中40-65倍叫高倍物鏡，90或100倍的稱為油浸物鏡(使用時需在標本和物鏡之間加入折射率大于1，而與玻璃折射率相近的液體，如香柏油作為介質)。

　　目鏡

　　安裝在鏡筒上端，因為它靠近觀察者的眼睛，又稱接目鏡。目鏡的作用是將由物鏡放大的實像進一步放大成一個起立的虛像，其作用相當于一個放大鏡。但它并不增加顯微鏡的分辨力。目鏡的鏡筒內可安裝一段頭發，在視野內則為一黑線，叫做“指針”，可以指示所觀察的部位。根據需要，目鏡內也可安裝測微尺，用以測量所觀察物體的大小。一般顯微鏡備有幾個放大倍數不同的目鏡，其放大倍數刻在目鏡邊框上，如5×、10×、15×等。(顯微鏡的總放大倍數=物鏡放大倍數×目鏡放大倍數)

　　聚光鏡

　　安裝在載物臺下方支架上，主要由聚光鏡和可變光闌組成。聚光鏡作用是會聚由反射鏡反射來的光線，增加標本的照明。可變光闌位于聚光鏡下方，又稱光圈，由十余片金屬薄片組成，中心部分形成圓孔。推動楞變光闌把手，可調節圓孔大小，以調節光線的強弱。升降聚光器，也可調節照明強度。在可變光闌下面，還有一個圓形的濾光片架，可根據鏡檢需要放置濾光片。

　　反射鏡

　　又叫反光鏡。安裝在聚光器或轉盤下方，其作用是把光源投射來的光向上反射到聚光器直到標本等。它楞以朝任意方向旋轉以對準光源。反射鏡通常一面是平面鏡，另一面是凹面鏡。沒有聚光器的顯微鏡，使用低物鏡時用平面鏡，使用高倍物鏡時則用凹面鏡，因凹面鏡也會有聚光作用。有聚光器的顯微鏡，一般用平面鏡，如果室內光線弱時，則可使用凹面鏡。

　　顯微鏡的工作原理

　　光學顯微鏡由兩組鏡片(目鏡和物鏡)組成，每組鏡片相當于一個凸透鏡。物鏡的焦距很短，目鏡的焦距較長。工作原理：物體先經過物鏡成放大的實像，再經目鏡成放大的虛像，二次放大，便能看清楚微小的物體。

　　1、顯微鏡的基本光學原理

　　(一) 折射和折射率

　　光線在均勻的各向同性介質中，兩點之間以直線傳播，當通過不同密度介質的透明物體時，則發生折射現象，這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。當與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時，光線在其介面改變了方向，并和法線構成折射角。

　　(二) 透鏡的性能

　　透鏡是組成顯微鏡光學系統的最基本的光學元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。

　　當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱"焦點"，通過交點并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱"物方焦點"，該處的焦平面，稱"物方焦平面";反之，在象方空間的焦點，稱"象方焦點"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。

　　光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現出來，而虛像不能。

　　(三) 凸透鏡的五種成象規律

　　1. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內、焦點以外形成縮小的倒立實象;

　　2. 當物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象;

　　3. 當物體位于透鏡物方二倍焦距以內，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象;

　　4. 當物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象;

　　5. 當物體位于透鏡物方焦點以內時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側比物體遠的位置形成放大的直立虛象。

　　2 光學顯微鏡的成象(幾何成象)原理

　　只有當物體對人眼的張角不小于某一值時，肉眼才能區別其各個細部，該量稱為目視分辨率ε。在最佳條件下，即物體的照度為50~70lx及其對比度較大時，可達到1'。為易于觀測，一般將該量加大到2'，并取此為平均目鏡分辨率。

　　物體視角的大小與該物體的長度尺寸和物體至眼睛的距離有關。有公式y=Lε

　　距離L不能取得很小，因為眼睛的調節能力有一定限度，尤其是眼睛在接近調節能力的極限范圍工作時，會使視力極度疲勞。對于標準(正視)而言，最佳的視距規定為250mm(明視距離)。這意味著，在沒有儀器的條件下，目視分辨率ε=2'的眼睛，能清楚地區分大小為0.15mm的物體細節。

　　在觀測視角小于1'的物體時，必須使用放大儀器。放大鏡和顯微鏡是用于觀測放置在觀測人員近處應予放大的物體的。

　　(一) 放大鏡的成像原理

　　表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學透鏡可以使物體放大成像，光路圖如圖1所示。位于物方焦點F以內的物AB，其大小為y，它被放大鏡成一大小為y'的虛像A'B'。

　　放大鏡的放大率

　　Γ=250/f'

　　式中250--明視距離，單位為mm

　　f'--放大鏡焦距，單位為mm

　　該放大率是指在250mm的距離內用放大鏡觀察到的物體像的視角同沒有放大鏡觀察到的物體視角的比值。

　　(二) 顯微鏡的成像原理

　　顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。

　　圖2是物體被顯微鏡成像的原理圖。圖中為方便計，把物鏡L1和目鏡L2均以單塊透鏡表示。物體AB位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像A'B'。 A'B'位于目鏡的物方焦點F2上，或者在很靠近F2的位置上。再經目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。虛像A''B''的位置取決于F2和A'B'之間的距離，可以在無限遠處(當A'B'位于F2上時)，也可以在觀察者的明視距離處(當A'B'在圖中焦點F2之右邊時)。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經放大了一次的像。

　　(三) 顯微鏡的重要光學技術參數

　　在鏡檢時，人們總是希望能清晰而明亮的理想圖象，這就需要顯微鏡的各項光學技術參數達到一定的標準，并且要求在使用時，必須根據鏡檢的目的和實際情況來協調各參數的關系。只有這樣，才能充分發揮顯微鏡應有的性能，得到滿意的鏡檢效果。

　　顯微鏡的光學技術參數包括：數值孔徑、分辨率、放大率、焦深、視場寬度、覆蓋差、工作距離等等。這些參數并不都是越高越好，它們之間是相互聯系又相互制約的，在使用時，應根據鏡檢的目的和實際情況來協調參數間的關系，但應以保證分辨率為準。

　　1. 數值孔徑

　　數值孔徑簡寫NA，數值孔徑是物鏡和聚光鏡的主要技術參數，是判斷兩者(尤其對物鏡而言)性能高低的重要標志。其數值的大小，分別標刻在物鏡和聚光鏡的外殼上。

　　數值孔徑(NA)是物鏡前透鏡與被檢物體之間介質的折射率(n)和孔徑角(u)半數的正弦之乘積。用公式表示如下：NA=nsinu/2

　　孔徑角又稱"鏡口角"，是物鏡光軸上的物體點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度。孔徑角越大，進入物鏡的光通亮就越大，它與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。

　　顯微鏡觀察時，若想增大NA值，孔徑角是無法增大的，唯一的辦法是增大介質的折射率n值。基于這一原理，就產生了水浸物鏡和油浸物鏡，因介質的折射率n值大于1，NA值就能大于1。

　　數值孔徑最大值為1.4，這個數值在理論上和技術上都達到了極限。目前，有用折射率高的溴萘作介質，溴萘的折射率為1.66,所以NA值可大于1.4。

　　這里必須指出，為了充分發揮物鏡數值孔徑的作用，在觀察時，聚光鏡的NA值應等于或略大于物鏡的NA值。

　　數值孔徑與其他技術參數有著密切的關系，它幾乎決定和影響著其他各項技術參數。它與分辨率成正比，與放大率成正比，與焦深成反比，NA值增大，視場寬度與工作距離都會相應地變小。

　　2. 分辨率

　　顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距，又稱"鑒別率"。其計算公式是σ=λ/NA

　　式中σ為最小分辨距離;λ為光線的波長;NA為物鏡的數值孔徑。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。

　　要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施

　　(1) 降低波長λ值，使用短波長光源。

　　(2) 增大介質n值以提高NA值(NA=nsinu/2)。

　　(3) 增大孔徑角u值以提高NA值。

　　(4) 增加明暗反差。

　　3. 放大率和有效放大率

　　由于經過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率Γ應該是物鏡放大率β和目鏡放大率Γ1的乘積：

　　Γ=βΓ1

　　顯然，和放大鏡相比，顯微鏡可以具有高得多的放大率，并且通過調換不同放大率的物鏡和目鏡，能夠方便地改變顯微鏡的放大率。

　　放大率也是顯微鏡的重要參數，但也不能盲目相信放大率越高越好。顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。

　　分辨率和放大倍率是兩個不同的但又互有聯系的概念。有關系式：500NA<Γ<1000NA

　　當選用的物鏡數值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結構，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節不清的圖像，稱為無效放大倍率。反之如果分辨率已滿足要求而放大倍率不足，則顯微鏡雖已具備分辨的能力，但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見。所以為了充分發揮顯微鏡的分辨能力，應使數值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。

　　4. 焦深

　　焦深為焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。焦深大, 可以看到被檢物體的全層，而焦深小，則只能看到被檢物體的一薄層，焦深與其他技術參數有以下關系：

　　(1) 焦深與總放大倍數及物鏡的數值孔徑成反比。

　　(2) 焦深大，分辨率降低。

　　由于低倍物鏡的景深較大，所以在低倍物鏡照相時造成困難。

　　5. 視場直徑(Field Of View)

　　觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場，它的大小是由目鏡里的視場光闌決定的。

　　視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。

　　有公式 F=FN/β

　　式中F: 視場直徑，FN：視場數(Field Number, 簡寫為FN，標刻在目鏡的鏡筒外側)，β:物鏡放大率。

　　由公式可看出：

　　(1) 視場直徑與視場數成正比。

　　(2) 增大物鏡的倍數，則視場直徑減小。因此，若在低倍鏡下可以看到被檢物體的全貌，而換成高倍物鏡，就只能看到被檢物體的很小一部份。

　　6. 覆蓋差

　　顯微鏡的光學系統也包括蓋玻片在內。由于蓋玻片的厚度不標準，光線從蓋玻片進入空氣產生折射后的光路發生了改變，從而產生了相差，這就是覆蓋差。覆蓋差的產生影響了顯微鏡的成響質量。

　　國際上規定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片?